May 23, 2023
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Nature Communications 14권, 기사 번호: 2836(2023) 이 기사 인용
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바이러스성 뇌염의 주요 사건 중 하나는 바이러스가 중추신경계(CNS)에 침투하는 능력입니다. 라크로스 바이러스(LACV)를 포함한 여러 뇌염 바이러스는 주로 어린이에게 뇌염을 유발하지만 성인은 유발하지 않습니다. 이 현상은 LACV 마우스 모델에서도 관찰되는데, 여기서 바이러스는 뇌 모세혈관 내피 세포(BCEC)를 통해 뇌 미세혈관의 혈관 누출을 통해 젖을 뗀 동물의 CNS에 접근할 수 있습니다. 혈관 누출의 연령 및 지역별 조절 요인을 조사하기 위해 우리는 게놈 전체 전사체학 및 표적 siRNA 스크리닝을 사용하여 억제가 BCEC의 바이러스 발병에 영향을 미치는 유전자를 식별했습니다. 이러한 유전자 산물 중 두 가지인 Connexin43(Cx43/Gja1)과 EphrinA2(Efna2)에 대한 추가 분석에서는 LACV 발병에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. 4-페닐부티르산(4-PBA)에 의한 Cx43의 유도는 젖을 뗀 생쥐의 신경 질환을 억제한 반면, Efna2 결핍은 성체 생쥐의 질병을 증가시켰습니다. 따라서 우리는 BCEC에 의해 발현되는 Efna2와 Cx43이 LACV 유발 신경 침범 및 신경 질환의 주요 중재자임을 보여줍니다.
분야바이러스과에 속하는 음성 RNA 바이러스인 라크로스 바이러스(LACV)는 어린이 아르보바이러스성 뇌염의 주요 원인 중 하나입니다2. 성인의 경우 LACV 감염은 일반적으로 매우 경미한 열성 증후군을 유발합니다3. 성인에 비해 어린이의 신경 질환 발병률이 높다는 것은 연령 관련 차이가 바이러스가 중추신경계(CNS)에 접근하거나 CNS 내 손상을 일으키는 능력에 원인이 될 수 있음을 시사합니다. 이러한 차이점을 이해하면 LACV 뇌염을 예방하거나 치료할 수 있는 방법이 제공될 수 있습니다.
혈액뇌장벽(BBB)은 선택적으로 투과하는 장벽으로 병원체가 중추신경계로 접근하는 것을 막는 데 중요한 역할을 한다. 혈액뇌장벽(BBB)은 주로 뇌 모세혈관 내피 세포(BCEC)와 인접한 성상교세포, 기저막 및 혈관주위세포로 구성되며, 주변 뉴런 및 미세아교세포와 상호 작용하여 신경혈관 단위4를 형성합니다. BCEC에 대한 선택적 투과성은 밀착 접합(TJ), 부착 접합(AJ) 및 간극 접합(GJ)(통칭하여 세포 접합(CJ)) 단백질과 함께 여러 운반체 및 운반체 단백질에 의해 정의됩니다5,6. BBB의 무결성은 개발 중에 강화됩니다7,8. 이는 성인기에 최고조에 달한 후 CJ 단백질 발현 감소 및 수송체 기능 장애로 인해 나이가 들면서 점차 약해집니다9,10.
LACV 뇌염에서 관찰된 병리학은 BBB의 실질적인 파괴를 나타냅니다. LACV 환자 뇌 생검의 면역조직화학(IHC) 분석은 면역 세포의 국소 집합체로 혈관주위 단핵 커핑을 보여주며, 추가 연구에서는 LACV 뇌염으로 인한 혈관 손상을 입증했습니다. 따라서 LACV 뇌염은 신경혈관 병리 및 이상과 밀접한 관련이 있습니다.
유사하게 연령 의존적 LACV 뇌염 및 혈관 병리가 C57BL/6 마우스 모델에서 관찰됩니다. 젖을 뗀 생쥐(~3주령)는 CNS의 LACV 감염에 매우 취약하며 말초(복강내, IP) 또는 직접 CNS 감염(뇌내, IC)에 따라 임상 질환이 발생합니다. 대조적으로, 6주령 이상의 성인 마우스는 말초 감염(IP)에 저항성이 있지만 직접적인 CNS(IC) 감염에는 취약합니다. 따라서 말초 감염 후 CNS에 접근하는 LACV의 능력에는 연령과 관련된 명확한 차이가 있습니다.
연령 관련 감수성에 대한 연구는 LACV 감염 후 어린 생쥐에서 혈관 누출이 증가하고 BBB가 파괴되는 것을 보여줍니다. LACV에 감염된 BCEC는 생체 내에서 쉽게 관찰되지 않지만 BBB의 분해는 특히 후각구(OB)/전후후각핵(AON) 영역의 미세혈관/BCEC를 통한 누출에 의해 매개되지만 피질(CT)에서는 그렇지 않습니다. ) 지역 16. 바이러스 누출은 일반적으로 감염 후 3일(dpi)에 최고조에 달하며 이러한 혈관 누출과 관련된 영역에서 뉴런의 바이러스 감염이 관찰됩니다. 이전 연구에서 우리는 뇌 미세혈관/BCEC의 연령별 반응이 차등적인 세포병변 효과와 LACV 감수성을 유발한다는 것을 입증했습니다. 또한, 생체 외 분리된 뇌 미세혈관 단편과 이유 및 성체 마우스로부터 분리된 1차 BCEC의 시험관 내 배양을 사용하여 우리는 이유 BCEC가 LACV 감염, 융합체 유사 응집체 형성 및 방관자 세포 사멸에 더 취약하다는 것을 보여주었습니다. BCEC 반응은 숙주 면역 반응, 세포 생존, 기능성 CJ 단백질의 발현, 혈관 유지 또는 다유전자 상호작용을 포함한 여러 요인에 의해 제어될 수 있습니다. LACV 감염 동안 이유기와 성인 뇌 미세혈관/BCEC 사이에 다른 요인을 식별하면 LACV 신경 침범을 예방하는 데 중요한 요인에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
6weeks old mice that had mixed deficiency genotypes for Efna2, Efna3 and Efna5 (Efna2−/− mixed; abbreviated as Efna2−/− (m)), as detailed in Supplementary Table 3. All mice were distributed in two groups: homozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2−/− (m) or heterozygous for Efna2 deficiency with mixed +/+, +/− or −/− genotypes for Efna3 and Efna5 (Efna2+/− (m)) as well as wildtype mice with Efna2+/+3+/+5+/+ genotype (wildtype, abbreviated as WT). Following inoculation of 105 PFU/mouse, approximately 50% of Efna2−/− (m) mice developed neurologic disease, regardless of their Efna3 or Efna5 genotype (Supplementary Table 3). In contrast, most of the WT or Efna2+/− (m) mice (~91%) did not show any signs of neurological disease (Fig. 4b). We also observed high levels of virus in the Efna2−/− (m) mice with clinical (C) neurological disease versus non-clinical (NC) mice (Fig. 4c). Thus, Efna2 appears to have an inhibitory role in LACV pathogenesis in vivo (Fig. 4b, c)./p> 6 weeks old) WT and Efna2−/−3+/+5+/+ mice (Efna2 single knockout (KO); abbreviated as Efna2−/−(s)). As expected, the adult WT mice were not susceptible to a 105 PFU/mouse LACV dose (~96% non-neurologic). In contrast, approximately 38% of adult Efna2−/− (s) mice developed neurological disease in response to LACV infection (Fig. 5a). Furthermore, microvessel fragments isolated from Efna2−/−(s) mice had higher levels of LACV infection compared to WT at 24 and 48 hpi (Fig. 5b, d) and reduced survival at 72 and 96 hpi (Fig. 5c). We also examined vascular leakage in vivo using fluorospheres in WT and Efna2−/− (s) mice using a slightly later timepoint of 5 dpi. WT adult mice showed no vascular leakage, while Efna2−/− (s) mice had consistent detection of 1–3 fluorescent bead foci in the brain parenchyma (Fig. 5e, 5 out of 7 mice). Thus, Efna2−/− (s) mice were more susceptible to LACV-induced neurological disease, which correlated with an increase in vascular leakage in the CNS prior to disease onset. This also correlated with increased virus infection and decreased cell survival in Efna2−/− (s) BCECs compared to WT BCECs (Fig. 5b, c). Collectively, these data indicate an important role for Efna2 in BBB integrity during LACV infection./p> 6 weeks old) mice were treated with 100 ug of Poly I:C (HMW) diluted in a 0.5 mg/mL LyoVec transfection reagent solution (Invivogen) via a 100 ul retroorbital (IV) injection. LyoVec reagent was reconstituted using the provided deionized sterile water per the manufacture's recommendations and was used alone as the vehicle control. Microvessel fragments were removed from treated and vehicle animals at 3 h post injection. For comparison of OB versus CT microvessel fragment transcript expression from LACV and mock infection conditions, C57BL/6 weanling mice were infected with a 2000 PFU IP dose of LACV diluted into 200 ul of sterile, pharmaceutical grade PBS. Mock mice received an equivalent volume of uninfected Vero supernatant diluted in PBS. Microvessel fragments from OB and CT were isolated from LACV and mock infected mice at 3 dpi. RNAs were extracted from microvessel fragments as described below and purified using Agencourt RNAClean XP beads (Beckman Coulter, Brea, CA). RNA concentration was measured using RiboGreen fluorescent RNA quantification method (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). RNA purity and integrity was assessed using Nanodrop 8000 UV spectrophotometry (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) and the Bioanalyzer RNA 6000 Pico chip assay (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), respectively. Sequencing libraries were generated from 115 ng (Adult/Weanling) or 170 ng (OB/CT) RNA using the TruSeq Stranded mRNA sample preparation kit, according to the manufacturer's recommended protocol (Illumina, Inc., San Diego, CA). Final, purified TruSeq libraries were quantified using the Kapa SYBR FAST Universal qPCR kit for Illumina sequencing (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), diluted to 2 nM, and pooled equally. Libraries were sequenced on the HiSeq 2500 instrument using the TruSeq Rapid PE Cluster kit and Rapid 200 cycle SBS kit (Illumina, Inc., San Diego, CA)./p> 6 weeks) were inoculated IP with 105 PFU. Mock inoculated mice were inoculated with 200 ul of PBS with the appropriate amount of cell supernatant from uninfected Vero cells to match the volume for virus dilutions. The whole brains or OB-CT regions were isolated separately from LACV and mock inoculated mice at 3 dpi. Supplementary Table 4 represents abbreviation of most of the experimental groups and other nomenclatures used throughout this manuscript./p>
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